TRANG CHỦ English  LIÊN HỆ
Khoa Sư phạm Kỹ thuật



CÁCH PHÂN LẬP VI KHUẨN

 CÁCH PHÂN LẬP VI KHUẨN TRONG DẠY THỰC HÀNH SINH HỌC Ở TRƯỜNG THPT

PGS.TS Biền Văn Minh 
Phân lập vi khuẩn là một quá trình tách rời một loại vi khuẩn từ quần thể vi sinh vật, sau đó gieo chúng lên bề mặt môi trường thạch dinh dưỡng chọn lọc. Sau khi ủ ở các điều kiện thích hợp các vi khuẩn sẽ phân chia nhiều lần tạo thành những quần thể mọc riêng biệt gọi là khuẩn lạc. Một ít tế bào trong khuẩn lạc được cấy truyền vào ống môi trường giữ giống và ủ ở các điều kiện thích hợp để chúng phát triển thành quần thể mới. Quần thể vi khuẩn trong ống nghiệm này được gọi là một chủng vi khuẩn hoặc là ống giống [1].
Chủng vi khuẩn thuần khiết (hay còn gọi là chủng sạch) được hiểu là thế hệ con, cháu, dòng có nguồn gốc từ một tế bào riêng lẻ. Các chủng vi khuẩn được thu nhận từ khuẩn lạc phân lập lần đầu chưa chắc đã thuần khiết vì một khuẩn lạc có thể được hình thành bởi một hoặc nhiều tế bào, vì thế phải làm sạch nhiều lần mới thu được chủng vi khuẩn thuần khiết.
Trong bài viết này chúng tôi muốn giới thiệu về cách phân lập vi khuẩn trong dạy thực hành sinh họcở trường Trung học phổ thông.
1. Chuẩn bị
a. Dụng cụ, thiết bị
Buồng cấy vô trùng; cân kỹ thuật - 1cái; giá ống nghiệm - 4 cái, mỗi giá có 10 ống nghiệm; đũa thủy tinh - 2 cái; que trang - 2 cái; que cấy - 5 cái, đèn cồn 2 cái, bếp điện - 2 cái, soong 2 lít - 2 cái; besher loại 500 ml – 2 cái; loại 250 ml – 2 cái; pipét loại 1ml - 2 cái, loại 5 ml - 2 cái; ống nghiệm - 50 ống; chai tam giác loại 250 ml - 6 chai; kéo cắt giấy - 1cái; dao thái -1cái; hộp Petri-25 hộp/ nhóm; khăn lau - 2 cái; bật lửa - 1 cái; ống nhỏ giọt - 2 cái.
 
 
b. Nguyên liệu và mẫu vật

 

- Bông không thấm nước 100g; nước cất 10 lít; cồn đốt 1000 ml; bông thấm nước; giấy thấm 1 hộp; giấy báo cũ để gói đĩa Petri; dây buộc bằng nilon;
- Môi trường thạch đĩa 30 hộp, thạch nghiêng 50 ống để nuôi cấy vi khuẩn
- Chai tam giác loại 250 ml chứa môi trường đã pha chế trước
- Đất vườn, đất đồi, mỗi loại 100-150g. Các ống giống vi khuẩn chuẩn.
- Chất ức khuẩn: streptomycin, penicillin, gentian violet v.v...
*Môi trường thạch - thịt – pepton có thành phần: Nước thịt 1000ml, pepton 10g, thạch (agar) 20g; pH=7,0; khử trùng 1 atm/30 phút.
*Môi trường nước mắm – pepton có thành phần: nước mắm 350 đạm 30ml, pepton 10g, thạch (agar) 20g; pH=7,0; khử trùng 1 atm/30 phút.
2. Nguyên tắc phân lập
- Gieo cấy vi khuẩn đã pha loãng trên môi trường dinh dưỡng đặc trưng (2% thạch hay còn gọi là agar).
- Nuôi dưỡng trong điều kiện thích hợp cho mọc các khuẩn lạc tách biệt nhau.
- Cấy tách từ khuẩn lạc mọc tách biệt sang ống môi trường dinh dưỡng thạch nghiêng để thu nhận chủng vi khuẩn thuần khiết (do Robert Koch đề ra).
3. Các bước tiến hành
a. Pha chế môi trường thạch đĩa, thạch nghiêng 
- Cân, đong chính xác từng thành phần môi trường
- Hòa tan các chất vào nước, đun và khuấy cho tan
- Làm trong môi trường, kiểm tra thể tích và pH
- Rót môi trường vào dụng cụ (ống nghiệm 1/4h, hộp Petri 1/3h, chai tam giác 1/2h). Làm nút bông, bao giấy họa báo
- Khử trùng ở nồi hấp áp lực hơi nước (0,8 – 1,0 atm/30 phút) tùy loại môi trường
- Chế môi trường thạch nghiêng và thạch đĩa [2], [3].
b. Thu mẫu, nuôi tích lũy và pha loãng
- Thu mẫu đất hoặc các cơ chất có vi khuẩn từ 100-150g, trường hợp số vi khuẩn có mặt ít trong mẫu thì phải nuôi tích lũy bằng cách ủ mẫu, bổ sung chất dinh dưỡng và các điều kiện lý, hóa cần thiết hoặc bổ sung các chất ức chế sinh trưởng của các vi sinh vật đi kèm.
 - Cân lấy 1g mẫu có vi khuẩn cho vào ống nghiệm chứa 9 ml nước cất vô trùng, khuấy bằng đũa thuỷ tinh cho tan hết mẫu. Ta có dung dịch mẫu pha loãng 10-1 lần.
- Lấy 1ml dịch huyền phù ở độ pha loãng10-1 đưa vào ống nghiệm chứa 9 ml nước vô trùng. Trộn đều ta có dịch pha loãng 10-2 lần.
Tiếp tục làm như trên, ta có một loạt độ pha loãng dịch mẫu khác nhau như ý.
c. Phân lập vi khuẩn hiếu khí và kị khí tùy tiện
- Cấy dịch huyền phù lên môi trường đặc trong hộp Petri
+ Dùng pipet vô trùng nhỏ 1ml dịch huyền phù đã pha loãng ở nồng độ nhất định lên bề mặt của môi trường trong hộp Petri.
+ Dùng que trang dàn đều giọt dịch huyền phù trên toàn bộ bề mặt môi trường hộp thạch.
+ Đậy hộp Petri, gói lại và đặt vào tủ ấm ở nhiệt độ 28 - 300C trong 48 - 72h.
- Trộn dịch mẫu pha loãng trong các môi trường thạch nóng chảy
Dùng pipet vô trùng nhỏ 1ml dịch huyền phù đã pha loãng ở nồng độ nhất định vào môi trường thạch đã nóng chảy và để nguội đến 45 - 500C trong bình nón, lắc đều. Bổ sung thêm một trong các chất ức khuẩn trên khoảng 0,3-0,5‰, tiếp tục lắc đều một lần nữa rồi đổ ra các hộp Petri mỗi hộp cở 15ml. Gói các hộp Petri lại, và đặt vào tủ ấm ở nhiệt độ 28 - 300C trong 48 - 72h.
-  Phân lập vi khuẩn bằng que cấy vòng
+ Nung đỏ đầu que cấy vòng (hình 2.1), làm nguội trong không khí khoảng 15s. Cho vòng que cấy chấm vào dịch huyền phù đã pha loãng có chứa vi khuẩn cần phân lập.
+ Tay trái hé mở nắp hộp thạch. Đặt đầu que cấy vào 1 góc hộp thạch, chấm nhẹ để loại bớt tế bào một lần nữa. Từ điểm này đẩy nhẹ đầu que cấy lướt nhanh trên bề mặt thạch theo đường zích zắc (hình 2.2). Xoay đĩa và tiếp tục vạch các đường zích zắc sao cho không trùng lên nhau trên khoảng trống còn lại, nhằm tạo điều kiện cho các khuẩn lạc mọc rời nhau ra. Đậy nắp hộp. Khử trùng que cấy trước khi cắm vào giá.
+ Các thao tác phải nhanh tay và làm trên ngọn lửa đèn cồn đặt trong tủ cấy, đảm bảo vô trùng.

 

 

Hình 2: Phương pháp phân lập vi khuẩn bằng que cấy vòng

1. Khử trùng đầu que cấy; 2. Đường cấy zích zắc trên bề mặt thạch dinh dưỡng; 3. Kết quả khuẩn lạc vi khuẩn mọc trên bề mặt thạch (hình có tính chất minh họa)
-  Nuôi dưỡng vi khuẩn
+ Nguyên tắc: Nuôi dưỡng là quá trình đảm bảo và duy trì những điều kiện thuận lợi nhất cho sự hoạt động và sinh sản của vi khuẩn.
+ Tiến hành : Úp ngược các hộp Petri rồi đặt vào tủ ấm ở nhiệt độ 28 - 300C trong 24 - 48h. Sau thời gian trên ở bề mặt thạch đĩa sẽ mọc các khuẩn lạc riêng biệt mắt thường quan sát được.
- Thu nhận chủng vi khuẩn thuần khiết
+ Cấy vi khuẩn từ khuẩn lạc mọc tách rời vào ống môi trường thạch nghiêng.
+ Nuôi vi khuẩn ở nhiệt độ và thời gian thích hợp.
         +  Loại bỏ các ống bị nhiễm, chọn ra các ống có các chủng thuần khiết.
- Phương pháp kiểm tra độ thuần khiết của một chủng vi khuẩn mới phân lập
Có nhiều cách kiểm tra:
* Kiểm tra vết cấy trên môi trường thạch đĩa: nếu vết cấy có bề mặt và màu sắc đồng đều, thuần nhất chứng tỏ chủng mới phân lập thuần khiết thì giữ lại. Nếu vết cấy không thuần nhất thì loại bỏ.
* Kiểm tra độ thuần khiết của các khuẩn lạc:
+ Khuẩn lạc có màu sắc, bề mặt, hình dạng đặc trưng giống như khuẩn lạc chủng mẫu.
+ Không có các màu sắc và sắc tố lạ.
+ Làm tiêu bản soi tươi dưới kính hiển vi thấy có hình dạng đặc trưng như chủng mẫu.
+ Tiến hành phân lập lại trong điều kiện vô trùng vẫn cho hình dạng khuẩn lạc tương tự.
+ Làm một số phản ứng sinh hóa định tính đặc trưng.
-  Các phương pháp giữ giống vi khuẩn sau phân lập
+ Cấy truyền định kỳ trên môi trường thạch nghiêng mới (1 tháng/1lần).
+ Giữ vi khuẩn ở nhiệt độ 4-50C trong tủ lạnh hoặc phòng lạnh.
+ Trộn vi khuẩn với glycerol vô trùng với tỉ lệ 1 : 20 và giữ ở nhiệt độ 3-50C.
+ Bảo quản vi khuẩn trong cát sạch đối với những chủng có bào tử.
+ Phương pháp đông khô v.v...
4. Thu nhận nhanh một số chủng vi khuẩn trong thực tế
Bên cạnh phương pháp phân lập như trên, tùy điều kiện từng trường chúng ta có thể tự thu nhận nhanh các chủng vi khuẩn để làm đối tượng thực hành sinh học THPT.
a. Phân lập trực khuẩn Bacillus subtilis(Gram dương sinh bào tử)
- Cỏ khô cắt nhỏ 5g, cho vào bình tam giác dung tích 250ml 200ml nước
- Bổ sung thêm 1g đất vườn, 1/4 viên phấn viết bảng
- Đun sôi 15 phút để diệt các tế bào sinh dưỡng
- Đậy nút bông, ủ ấm ở nhiệt độ 300C trong 72h
Kết quả: Xuất hiện lớp váng xám có nhiều trực khuẩn Bacillus subtilis
Trên kính hiển vi các tế bào Bacillus subtilis có dạng hình que, kích thước khoảng 3-5 ´ 0,6 mm, mỗi tế bào chỉ có một bào tử hình ô van và không làm biến dạng tế bào.
b. Thu nhận liên cầu khuẩn Streptococcus lactis (Gram dương không sinh bào tử)
- Lấy 2 ml sữa chua Vinamilk hòa loãng với 3ml nước cất, ta được 5ml dung dịch chứa liên cầu khuẩn Streptococcus lactis.
c. Thu nhận Rhizobium leguminosarum (Gram âm không sinh bào tử)
- Chọn 2-3 nốt rễ cây đậu lạc (đậu phụng)(Arachis hypogaeaL.) mọc trên rễ chính có kích thước lớn, có màu đỏ hồng, rửa sạch, ngâm cồn 5 phút, rửa nước, nghiền nát bằng kim mũi mác, bổ sung thêm 3ml nước cất ta thu được dịch chứa vi khuẩn trên.
* Câu hỏi
1) Trình bày các nguyên tắc và phương pháp phân lập vi khuẩn thuần khiết.
2) Nguyên tắc của việc nuôi tích lũy?
3) Thế nào là chủng vi khuẩn thuần khiết (chủng sạch)?
5. Kết luận
Hiện nay một sốnội dung trong sách sinh học THPT phần thực hành có liên quan đến đối tượng vi khuẩn khó thực hiện được vì thiếu các chủng vi khuẩn thuần khiết. Căn cứ vào chương trình sinh học THPT, chúng tôi đề xuất cách phân lập vi khuẩn hiếu khí và kị khí tùy tiện khi có đầy đủ các thiết bị cần thiết và giới thiệu cách thu nhận nhanh các chủng vi khuẩn Gram dương có bào tử (Bacillus subtilis); liên cầu khuẩn (Streptococcus lactis) không có bào tử, vi khuẩn Gram âm không sinh bào tử (Rhizobium leguminosarum) dùng làm đối tượng dạy thực hành sinh học THPT.
Khi phân lập cần lưu ý: các hộp thạch môi trường phải vô trùng có bề mặt khô nước và có độ rắn chắc, không gồ ghề, giúp các khuẩn lạc vi khuẩn mọc rời nhau ra. Để phòng sự nhiễm tạp do không khí bẩn, các thao tác phải tuyệt đối vô trùng.
Các chủng sau khi làm sạch cần được kiểm tra lại bằng cách quan sát hình dạng tế bào dưới kính hiển vi cũng như xác định lại các hoạt tính đã biết.
Việc tạo ra một chủng vi khuẩn thuần khiết cũng như bảo quản khỏi bị tạp nhiễm là việc làm có ý nghĩa rất lớn trong học tập, nghiên cứu cũng như sản xuất.      
 Tài liệu tham khảo
1. Vũ Thị Minh Đức, Thực tập vi sinh vật học, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội năm 2001, trang 28-39.
2. Biền Văn Minh, Phân lập, tuyển chọn vi sinh vật kiểm định ở Thừa Thiên Huế dùng làm đối tượng dạy thực hành vi sinh vật tại khoa sinh, trường ĐHSP-ĐH Huế, Tạp chí khoa học giáo dục, trường ĐHSP Hà Nội số 3 năm 2003, trang 84-86.
3. Egorov N.X., Thực tập Vi sinh vật, NXB Mir, Maxcơva. Nguyễn Lân Dũng dịch, 1983. NXB ĐH&THCN Hà Nôi, 1983.

(Tạp chí TBGD số 51, tháng 11/2009)

Khoa spKT
In trang          (Cập nhật: 23:13:18-13/02/2010)
---------------------------------------------------------------------------------------
Các bài báo, báo cáo khoa học: Từ năm 2000 đến nay
Kế hoạch công tác tháng 11&12 năm 2012
200 câu hỏi và trả lời về môi trường: Câu 1-100
Quy chế đào tạo đại học chinhys quy theo HTTC
Mời họp mặt nhân kỷ niệm 55 năm thành lập trường
Khoa Sư phạm Kỹ thuật
Thông báo họp mặt CB-SV toàn khoa nhân kỷ niệm 55 năm thành lập Trường
Mời viết bài cho tập: "Ký ức thời gian" - cấp Trường
BIỀN VĂN MINH
HỒ ĐẮC THÁI HOÀNG
NGUYỄN KHOA LÂN
DƯƠNG VIẾT TÌNH
PHẠM QUANG CHINH
NGUYỄN BÁ LỘC
TRƯƠNG THỊ BÍCH PHƯỢNG
Các tin đã đưa
Các bài báo, báo cáo khoa học: Từ năm 2000 đến nay (25/02/2013)
Kế hoạch công tác tháng 11&12 năm 2012 (25/11/2012)
200 câu hỏi và trả lời về môi trường: Câu 1-100 (01/10/2012)
Quy chế đào tạo đại học chinhys quy theo HTTC (30/09/2012)
Mời họp mặt nhân kỷ niệm 55 năm thành lập trường (08/02/2012)
Khoa Sư phạm Kỹ thuật (30/09/2012)
Thông báo họp mặt CB-SV toàn khoa nhân kỷ niệm 55 năm thành lập Trường (24/01/2012)
Mời viết bài cho tập: "Ký ức thời gian" - cấp Trường (24/01/2012)
BIỀN VĂN MINH (09/02/2011)
HỒ ĐẮC THÁI HOÀNG (09/02/2011)
NGUYỄN KHOA LÂN (09/02/2011)
DƯƠNG VIẾT TÌNH (09/02/2011)
PHẠM QUANG CHINH (09/02/2011)
NGUYỄN BÁ LỘC (09/02/2011)
TRƯƠNG THỊ BÍCH PHƯỢNG (09/02/2011)
© 2008 Trường Đại học Sư phạm Huế
Các trình duyệt hỗ trợ tốt: Google Chrome, Firefox, Opera, Safari